血瘀证为中医常见证候，是瘀血内阻，以疼痛、肿块、出血、瘀血为主要体现的病证，凡离开经脉之血不能及时消散和瘀滞于某一处，停留体内使得血运不畅，或血流循行迟缓不流畅，郁积于经脉或器官之内呈凝滞状态均为瘀血 [1] 。微循环障碍是血瘀证的基本病理变化和客观指标 [2] ，当凝血功能出现障碍时，会造成明显的微循环障碍，血流缓慢 [3] 。血小板的活化、聚集和释放是造成血瘀的重要生理和病理基础，血液在组织器官中呈瘀滞状态 [4] ，血小板的活化、聚集、释放等功能增强，均会使血液处于高凝状态，血行不畅，形成血栓。血小板功能活化和瘀血最终都可能会导致血瘀证。血瘀会阻碍气血运行，导致气血运行缓慢，如果血瘀长期得不到有效的治疗，会在局部形成肿块。还会导致心脏供血不足，长此以往，会逐渐发展为冠心病，引起胸闷、疼痛等症状。现代研究表明血小板功能障碍是造成心血管疾病的主要的因素之一，而且由于其调控机制复杂、药物的作用靶点繁多等原因，目前关于血小板功能的相关研究慢慢的变成了如何治疗心血管疾病的关键。其中，中药抗血小板的作用显著 [5] 。

  丹红注射液是一种中药注射剂，主要由丹参、红花组成。丹参性苦、微寒，归心、肝经，具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈的功效；红花辛、温，归心、肝经，具有活血通经、散瘀止痛的功效 [6-8] ；二者合用，是近代医家常用的经典药对，常用来医治“胸痹”等心血管疾病 [9] 。现代药理学研究表明，丹红注射液具有抗凝 [10] 、抗炎、抗氧化、调血脂、促血管新生的功效 [11-12] ，但其对治疗血瘀和抗血小板功能的作用机制研究未见详细报道，本课题组前期成功建立了基于抗凝血活性的丹红注射液生物效价的测定方法，明确了丹红注射液抗凝血活性可作为其质量评价的标准 [13] ，在此基础上，本研究通过建立急性血瘀大鼠模型，在整体上探讨丹红注射液活血化瘀作用的特点，并围绕抗凝和抗血小板功能，从分子水平上还原丹红注射液治疗血瘀及抗血小板功能的作用机制，为丹红注射液临床治疗血瘀证及心血管疾病提供科学依据。

  SPF 级雄性 SD 大鼠 60 只， 6 周龄，体质量 170 ～ 200 g ，由浙江维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号 SCXK （浙） 2019-0001 ，合格证号 20211117Aazz0619000332 。动物于标准化室温（ 22 ± 2 ）℃、相对湿度（ 55 ± 5 ） % 、 12 h 昼夜交替的环境中适应性饲养 1 周，自由进食饮水。动物实验经河南中医药大学实验动物伦理审查批准（批准号 DWLLGZR202202018 ）。

  动物适应性饲养 7 d 后，随机分为空白组、模型组、舒血宁注射液（ 1.8 mL/kg ）组和丹红注射液高、中、低剂量（ 1.4 、 0.7 、 0.35 mL/kg ，分别相当于临床剂量的 2 、 1 、 0.5 倍） [14] 组，每组 10 只。各给药组每日 9: 00 时尾 iv 药物，空白组和模型组尾 iv 等体积生理盐水， 1 次 /d ，连续给药 11 d 后开始造模，空白组 sc 生理盐水，其余各组 sc 盐酸肾上腺素（ 0.8 mg/kg ）， 2 h 后将各组大鼠置于 0 ～ 4 ℃冰水中游泳 5 min ，擦干背毛， 2 h 后再次 sc 盐酸肾上腺素（ 0.8 mg/kg ），造模后各组禁食不禁水 12 h 以复制急性血瘀模型。第 12 天给药 30 min 后， ip 2% 戊巴比妥钠（ 3 mL/kg ）麻醉，观察耳廓微循环、心电图；腹主动脉取血，检测血液流变学指标、凝血功能指标，解剖后取心尖及以上 1 cm 组织、腹主动脉组织。

  实验期间，每天给予充足饲料及饮水，使各组大鼠体质量呈稳态增长，每日观察各组大鼠体质量变化。造模后对大鼠毛色、精神情况、活动情况、排便情况、进食饮水情况、边缘耳廓瘀点情况等均进行观察。

  末次给药 30 min 后，大鼠 ip 2% 戊巴比妥钠麻醉，腹主动脉取血，肝素钠抗凝，室温静置 20 min 后，采用血液流变测试仪检测 1/s 、 5/s 、 50/s 、 100/s 、 200/s 切变率下的全血黏度。使用一次性使用负压采血管（枸橼酸钠 1 ∶ 4 ）抗凝，动态血沉 / 压积测试仪测定血沉，血沉测定结束后， 3000 r/min 离心 30 min ，测定红细胞压积。

  大鼠麻醉后，腹主动脉取血，一次性使用负压采血管（枸橼酸钠 1 ∶ 9 ）抗凝， 3500 r/min 离心 10 min ，取上层血浆用于 APTT 、 PT 、 TT 、 FIB 的测定。

  将麻醉后的大鼠仰卧固定于大鼠固定板上，采用生物机能实验系统，记录心电的 5 个电极一端与信号采集与处理系统硬件相连接，另一端夹子分别夹在穿过大鼠右前肢（红）、左前肢（黄）、右后肢（黑）、左后肢（绿）及胸部（白）皮下的针式电极上，记录标准肢体导联 —— II 导联心电图，每只大鼠稳定后记录 2 min 。软件参数设置为：采样频率 1 kHz ，量程 2 mV ，放大滤波器 100 Hz 。

  使用激光多普勒系统测定耳廓血流量，血流仪先进行 20 min 预热并用校准液进行校准，选用多普勒血流探头固定于俯卧大鼠右侧距耳廓边缘 5 mm 光滑平坦处双面胶固定，血流仪将采集的信号转换成灌注量单位（ perfusion unit ， PU ），采用配套软件进行 PU 值曲线的输出、记录，取稳定的 1 min 曲线值的平均值作为其耳廓血流量值。

  取各组大鼠腹主动脉、心脏，经过 4% 多聚甲醛固定、脱水透明后石蜡包埋，切片（厚 1 mm ）后进行苏木素 - 伊红（ HE ）染色，于显微镜下观察并拍照，利用 CaseViewer 软件进行分析。

  数据采用 IBM SPSS Statistics 25 软件处理，计量资料采用 表示，组间比较采用单因素方差分析（ One-way ANOVA ），方差齐采用最小显著差异法 LSD 检验，方差不齐采用多重比较（ Dunnnett’T3 ）检验。

  如表 1 所示，给药 11 d 后，各组间大鼠体质量无统计学意义。造模后大鼠出现精神不振、蜷缩不动或活动减少，反应迟钝，弓背、耸毛、皮毛无光泽，喜扎堆、畏寒喜暖、四肢发冷、寒战，爪尾部、舌部紫暗，耳廓出现瘀点紫暗（图 1 ），饮水、进食量减少，大便湿烂、肛门污秽等证候表现，上述证候符合中医血瘀的辨证诊断。

  如表 3 所示，与空白组比较，模型组压积、红细胞聚集指数、卡松黏度均非常明显升高（ P ＜ 0.05 、 0.01 ）；与模型组比较，丹红注射液高剂量组压积、 红细胞聚集指数、卡松黏度均明显降低（ P ＜ 0.05 、 0.01 ），舒血宁注射液组卡松黏度明显降低（ P ＜ 0.05 ）。

  如表4 所示，与空白组比较，模型组APTT 、PT 显著缩短（P ＜0.01 ），FIB 明显地增加（P ＜0.01 ）；与模型组比较，丹红注射液各剂量组TT 均显著延长（P ＜0.05 、0.01 ）。

  如图2 所示，模型组大鼠Q 波异常，损伤型ST 段明显抬高，心率无改变，提示出现心肌缺血。如表5 所示，与空白组比较，模型组ST 段显著抬高（P ＜0.01 ）；与模型组比较，各给药组ST 段均明显降低（P ＜0.05 、0.01 ）。

  如表 6 所示，与空白组比较，模型组大鼠 PU 明显降低（ P ＜ 0.01 ），说明急性血瘀证模型大鼠可以导致耳廓局部微循环障碍；与模型组比较，各给药组 PU 均非常明显升高（ P ＜ 0.05 、 0.01 ），表明 DHI 可改善急性血瘀证微循环障碍。

  如图 3 所示，空白组大鼠动脉内、中、外膜结构完整，层次分明，弹性纤维层结构基本清晰，走向基本一致，排列较整齐；模型组大鼠主动脉各层 结构松散无序，内膜出现轻微损伤，弹力纤维破坏，由于斑块脱落导致慢慢的出现空泡；各给药组大鼠内皮结构基本完整，丹红注射液高剂量组大鼠主动脉结构松散无序，丹红注射液中剂量组大鼠主动脉结构弹力纤维被破坏，但结构基本清晰，与模型组相比损伤所致程度较低。

  如图 4 所示，空白组心肌纤维结构排列整齐紧密，心肌及内膜细胞连续完整，心肌细胞染色均匀，细胞核致密，无水肿，未见炎细胞浸润；模型组可见心肌细胞排列稍乱，心肌纤维间隔增宽、肿胀、 断裂，出现空泡变性，可见部分肌纤维坏死，心肌细胞加宽，细胞核增大变圆。各给药组也出现心肌纤维增宽，但较模型组均有不同程度的改善，空泡变性也有所改善，均趋于空白组。与模型组比较，各给药组表现出较好的心肌保护作用，心肌排列较整齐，空泡现象轻于模型组，舒血宁注射液组和丹红注射液高剂量组细胞核形状趋于空白组。

  3.8.1 血小板活化黏附相关指标 如表7 所示，与空白组比较，模型组FN 、vWF 含量显著上升（P ＜0.01 ）；与模型组比较，各给药组FN 、vWF 含量显著下降（P ＜0.01 ）。

  3.8.3 血小板释放相关指标 如表 9 所示，与空白组比较，模型组 β-TG 、 PF4 含量显著上升（ P ＜ 0.01 ）；与模型组比较，各给药组 PF4 含量明显降低（ P ＜ 0.05 、 0.01 ），舒血宁注射液组和丹红注射液高、中剂量组 β-TG 含量显著下降（ P ＜ 0.05 、 0.01 ）。

  3.9 丹红注射液对急性血瘀大鼠心肌组织Akt1、p38和ERKmRNA表达的影响

  如表10 所示，与空白组比较，模型组心肌组织内 Akt1 、 p38 、 ERK 的mRNA 表达水平均显著上升（ P ＜0.01 ）；与模型组比较，各给药组 Akt1 、 p38 、 ERK的mRNA表达水平均显著下降（P＜0.01）。

  本研究采用注射肾上腺素模拟人体暴怒时所引起的心率加快、体温升高的状态，再结合冰水浴，在刺激神经和寒邪二者共同作用下复制寒凝血瘀的模型，可很好地印证中医对于血瘀证“寒则凝，凝则成瘀”的认识 [15-17] 。寒凝血瘀是导致多种疾病发生发展的病理基础，全血黏度增加、血液流动性减弱、凝血时间缩短、微循环障碍、血管损伤与血小板活化、释放和聚集等均与寒凝血瘀证相关[18] 。微循环是心血管系统在组织内真正发挥功能的部位，微循环障碍会造成血液理化性质的改变，使管腔狭窄，血流减慢或血栓形成，使局部组织缺血缺氧甚至坏死，引起一系列的临床症状。微循环与血瘀证息息相关，临床上常运用活血化瘀的药物改善微循环以达到活血通络化瘀的功效[19] 。

  本研究结果为，模型组大鼠的行为状态、瘀证表现、 TT 、耳廓微循环血流量显著减少，血液全血黏度显著上升，以上评价指标符合在1982 年经中国中西医结合学会活血化瘀委员会批准的血液流变学可作为判断血瘀证和血瘀证治疗效果的依据[20] ，证明血瘀证大鼠模型造模成功。与模型组比较，丹红注射液组大鼠耳廓瘀点减轻，TT 、全血黏度与耳廓微循环均有明显改善，可见丹红注射液有活血化瘀、通脉活络、改善微循环、降低血黏度的效果，能从整体上改善血瘀症状，该作用与阳性对照药物舒血宁注射液不一样，舒血宁注射液虽能够改善微循环和血液流变学指标[21] ，对心肌和血管内皮具有某些特定的程度的保护作用，对血小板功能具有不一样程度的改善，但却无明显抗凝作用。

  现代医学表明，寒凝血瘀会导致血管收缩、血管内皮损伤，其特征之一是 TXA2 与前列环素（prostacyclin ，PGI2 ）的失衡，TXA2 与PGI2 的平衡状态可维持冠脉张力和血小板内环境稳定。正常条件下，血小板功能被PGI2 等抗凝物质抑制，而在炎症条件下，vWF 与其表面受体糖蛋白Ib-IX-V （platelet glycoprotein Ib-IX-V complex ，GPIb-IX-V ）复合物被激活，二者结合活化整合素αIIb/β3 ，使其与vWF 或纤维蛋白原结合，促进血小板聚集、活化以及血栓的形成[22] ，vWF 能够使血小板黏附于血管内皮细胞，发挥止血功能，还可作为判断血管内皮的损伤所致程度及血栓风险的重要指标[23-24] ，vWF 与GPIb-IX-V 的结合可以诱导其下游的重要信号通路磷脂酰肌醇3- 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase ，PI3K ）/Akt 和依赖性蛋白激酶（cGMP-dependent protein kinase ，PKG ）/ 丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase ，MAPK ）分子的激活[25] ，即Akt 和P38 以及ERK 的活化[26] ，同时PI3K/Akt 和MAPK 信号通路可以明显地增强凝血因子释放和TXA2 产生[27] ，若TXA2 等促凝物质生成增加，PGI2 等抗凝物质生成减少，进一步促进血管收缩、血小板活化、聚集、血栓形成等病理表现[28] 。该病理过程刺激血小板产生大量的PF4 、β-TG ，出现凝血、炎症等生理反应[29] ，形成恶性循环。TXA2 由血小板微粒体合成释放，不稳定，其水解产物为稳定的TXB2 ；PGI2 具有较强的抑制血小板功能的作用，半衰期很短，一般检测指标为其稳定的代谢产物6-keto-PGF1α[30] 。PF4 是血小板活化的特异性指标，血小板活化后被大量释放，黏附于受损的血管内皮表面[31] ，促进炎性巨噬细胞分化，抑制血管再生[32] ；β-TG 是血小板α 颗粒内的糖蛋白，机体缺血后β-TG 被释放至血小板外[33] ，二者能够反映血小板活性。FN 能够在一定程度上促进细胞的黏连生长，加强血小板的黏附过程，在损伤的局部形成血小板血栓，具有保护血管内皮细胞的功能[34] 。本研究中，模型组大鼠心肌细胞纤维断裂、出现空泡和凋亡现象，并且腹主动脉血管内皮出现损伤，心电图显示模型组ST 段显著抬高，提示心肌缺血严重；同时，TXB2/6-keto-PGF1α 值升高，PF4 、β-TG 、FN 、vWF 水平升高，vWF/GPIb-IX-V 信号通路激活，其下游分子Akt1 、p38 、ERK 水平上调，表明模型组大鼠体内有血小板聚集、活化等病理过程。给药后，丹红注射液组大鼠心肌细胞纤维排列较整齐、空泡凋亡现象减少，对腹主动脉血管内皮也有不同程度的改善，心电图回到正常状态，同时，TXB2 降低，6-keto-PGF1α 升高，表明丹红注射液可保护心肌和血管内皮细胞，减少心脏损伤、血管内皮损伤及炎症状态，化瘀血生新络，调节TXB2/6-keto-PGF1α 的平衡关系，降低PF4 、β-TG 、FN 、vWF 水平，显著下调Akt1 、p38 和ERK 的水平，抑制GPIb-IX-V 信号通路介导的血小板活化、聚集和释放，发挥抗凝和抗血小板功能的作用，增加微循环血流量，维持血流正常状态，起到治疗血瘀证的效果。

  本研究成功复制急性血瘀证大鼠模型，丹红注射液能够从整体上改善寒凝血瘀证模型大鼠中医证候，保护细胞内膜和纤维完整，并通过调控 vWF/GPIb-IX-V 下游信号通路相关蛋白及基因表达，降低vWF 、FN 、TXB2/6-keto-PGF1α 、PF4 和β-TG 水平，从而保护心肌、改善凝血和血小板功能，达到治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病、心绞痛、心肌缺血等临床疾病[12] 的作用，为其在中医防治血瘀证及治疗心血管疾病方面提供了参考。

  来 源：刘 旭，吴宿慧，陈小菲，张宇航，李寒冰，唐进法．基于vWF/GPIb-IX-V信号通路的丹红注射液对急性血瘀大鼠模型活血化瘀作用及机制研究 [J]. 中草药, 2023, 54(4):1173-1183.

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