糖尿病是以糖代谢紊乱及体液失衡为主要体现的疾病，可由遗传因素及外因共同导致，并随着疾病进展合并其他器官疾病，致残率、致死率均较高。

  2型糖尿病（diabetesmellitustype2，T2DM）是糖尿病发病主要类型，当前全球约有2亿患者，新增患者大多分布在在发展国家，给患者造成极大危害，同时也增加了经济负担。

  胰岛素抵抗(insulinresistance，IR)是T2DM的发病机制之一，胰岛素代谢反应减低导致机体血糖居高不下，加重糖代谢紊乱，不利于病情稳定。

  内质网应激(endoplasmicreticulumstress，ERS)是一种适应性保护调节作用，可通过增加内质网的折叠能力减少损伤蛋白质从而恢复其稳态性。

  机体血糖持续升高，ERS反应剧烈可促进胰岛β细胞紊乱、触动促凋亡因子而诱发胰岛素抵抗。

  T2DM属于一种低炎症疾病，肿瘤坏死因子-α（tumornecrosisfactor，TNF）和单核细胞趋化蛋白-1(monocytechemoattractantprotein-1，MCP-1)是参与T2DM发展的主要炎症介质，高糖对肾脏组织造成损伤，肾脏固有细胞分泌TNF-α等炎症因子，增加了炎症联级反应及机体损伤。

  在T2DM小鼠外周血中MCP-1、TNF-α表达升高，推测其可通过促炎作用而推动疾病进展。

  中医学在T2DM治疗中逐渐发挥及其重要的作用，中医将T2DM归属为“消渴”范畴，可采用补脾肾、化痰浊及清肺胃的药物治疗。

  黄连化浊胶囊又称黄金胶囊，具有清热解毒、运脾化浊等功能，已证实具有调节脂质代谢提高胰岛素敏感性的作用。

  本文通过建立T2DM大鼠模型探讨黄连化浊胶囊对ERS、IR及MCP-1/TNF-α的作用，为相关研究提供参考依据。

  60只SPF级SD雄性大鼠，5~6周龄，体重（250±50）g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，动物生产许可证号：SCXK（鲁）20190003，大鼠饲养于我院附属大学实验动物中心SPF级实验动物房，湿度为55%~60％，温度25℃，模拟黑白交替无菌饮食14d，每5只大鼠1个笼子，定时清洗、消毒鼠笼。

  本次实验经甘肃中医药大学动物伦理会审核批准（编号：2022-0113）。

  黄连化浊胶囊（黄连9g，鸡内金12g，法半夏9g，竹茹15g，枳实9g，陈皮9g，茯苓15g，炙甘草9g），甘肃中医药大学附属医院院内药剂（批准文号：甘药制字Z120110），批号171103。

  盐酸二甲双胍（格华止），中美上海施贵宝制药有限公司（批号：20201120）。

  链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)，北京索莱宝科技有限公司；4%四聚甲醛，默克生命科学技术(南通)有限公司；磷酸缓冲盐溶液(phosphatebuffersaline，PBS)，康迪斯化工(湖北)有限公司；H-E染色试剂盒，南京建成生物工程研究所；免疫组化试剂盒、ECL化学发光液、酶联免疫试剂盒、BCA蛋白定定量试剂盒，上海酶联生物科学技术有限公司；GRP78、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH)抗体，GeneTex公司；MCP-1单抗、TNF-α单抗，上海复申生物科技有限公司。

  DA7600实时荧光定量PCR仪，中山大学达安基因股份有限公司；伯乐ChemiDocMP化学发光凝胶成像系统，Bio-Rad公司；IX71型倒置拍照显微镜，上海赖氏电子科技有限公司；电泳仪，北京六一仪器厂。

  60只SPF级SD雄性大鼠分为对照组、糖尿病组、黄连化浊胶囊低剂量组、黄连化浊胶囊中剂量组、黄连化浊胶囊高剂量组及双胍干预组，每组10只。

  大鼠建模：对照组正常饲料喂养，其余5组大鼠均以高脂饲料喂养6周，空腹饲养6h后腹腔每日单次注射60mg/kg的STZ，连续注射3次建立T2DM大鼠模型。

  连续3次采集尾部静脉血，当空腹血糖≥11.1mmol/L-1、餐后2h血糖≥16.7mmol/L-1为建模成功，本实验所有大鼠均建模成功。

  黄连化浊胶囊组按照人与大鼠体表面计算及文献灌胃相应药物剂量，高剂量为2.025g/kg，中剂量为1.265g/kg，低剂量为0.675g/kg；双胍干预组灌胃0.2g/kg的二甲双胍；对照组及糖尿病组灌胃体积相同的生理盐水，每日1次，连续10周。

  各组大鼠均建模成功，无死亡大鼠，灌胃期间对照组继续采用正常饲料喂养，其余大鼠继续采用高脂饲料喂养。

  治疗前后禁食12h，采用1%戊巴比妥钠以40mg/kg剂量进行腹腔麻醉，取腹主动血5ml，3ml以3500r/min离心15min（离心半径12cm），血清于-20℃中保存待检。

  采用放射免疫方法检验测试血清中空腹胰岛素（fastingserumlisulin，FINS），严格按照试剂盒说明书进行。

  取血后，快速剪取新鲜部分胰腺组织，用0.9%生理盐水清洗后切片，保存于–196℃液氮中。

  胰腺组织取入10%甲醛溶液中固定，纵向切片，放入脱钙剂中脱钙，后石蜡包埋切片厚度4μm，低温保存。

  取4μm石蜡切片，放入37℃复温15min，二甲苯脱蜡后梯度乙醇脱水，苏木精染色10min，盐酸（质量分数为1%）处理，伊红复染，脱水中性树脂封片，观察组织形态。

  提取胰腺石蜡包埋切片，逐层乙醇脱水，加入PBS冲洗5min，重复3次，加入20μg/mL的蛋白酶K溶液，在23℃下孵育30min，PBS冲洗后放入3%的H2O2，15min后再次用PBS冲洗，擦片后放入50μL的TUNEL反应液，37℃下孵育60min。

  PBS冲洗，加入50μL转化剂过氧化物酶(peroxidase，POD)，用抗荧光淬灭封片液封片后观察。

  凋亡细胞呈现荧光绿色，每张切片选择5个非重叠视野，计算胰岛β细胞凋亡率（凋亡/总细胞×100%）。

  次日60℃下恒温保存40min，放入二甲苯中脱蜡，再次进行梯度乙醇透水，蒸馏水浸泡5min。

  微波炉加热进行抗原修复，沸腾后加热60s、闷5min，重复上述做法2次，冷却到室温，PBS洗涤。

  PBS洗涤3次，采用山羊血清封闭20min，在4℃冰箱中孵育过夜，加入GRP78（1∶200）、ATF6（1∶150）一抗，加入生物素标记山羊抗小鼠/兔IgG聚合物二抗（1∶1000）10min，PBS冲洗3次，加入DAB显色剂，苏木精复染40s，清水返蓝30s，中性树胶封片，随机选择5个视野计算阳性细胞数。

  胰腺组织采用PBS冲洗后切碎，加入1mL的细胞裂解液，10000×g 4℃离心5min，取上清液，加入样孔中，采用BCA法测总蛋白浓度，每孔上样蛋白量20μg，进行SDS-PAGE。

  转印缓冲液配制好后要放入4℃冰箱内预冷，然后全部转移到PVDF膜上，加入脱脂奶粉，全程封闭1h。

  采用GraphPadPrism8软件分析，所有数据符合正态分布，采用x±s表示，组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。

  治疗前各组大鼠体重、FPG、HbAlc、HOMA-IR及FINS水平比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。

  治疗后，与对照组相比，糖尿病组大鼠FPG、HbAlc、HOMA-IR及FINS水平均升高、体重降低（P＜0.05）；与糖尿病组相比黄连化浊胶囊低剂量组差异无统计学意义（P＞0.05），黄连化浊胶囊中、高剂量组及双胍干预组FPG、HbAlc、HOMA-IR及FINS水平均降低、体重升高（P＜0.05）；与黄连化浊胶囊中剂量组相比，黄连化浊胶囊高剂量组FPG、HbAlc、HOMA-IR及FINS水平均降低、体重升高（P＜0.05）；黄连化浊胶囊高剂量组与双胍干预组体重、FPG、HbAlc、HOMA-IR及FINS水平差异均无统计学意意义（P＞0.05）。

  对照组大鼠胰岛结构完整，胰岛细胞清晰可见，多呈现圆形或椭圆形，形态饱满，排列均匀。

  糖尿病组大鼠胰岛明显萎缩，无法清晰观察到胰岛细胞界限，细胞形态不规则且排列紊乱，胰岛间质中出现大量空泡，可见严重炎症浸润。

  与糖尿病组比较，黄连化浊胶囊低、中及高剂量组及双胍干预组胰岛形态及功能均出现不同程度的改善，其中高剂量组最佳，细胞数目增多，形态改善，无炎性浸润。

  对照组、糖尿病组、黄连化浊胶囊低、中、高剂量组及双胍干预组的胰岛β细胞凋亡率分别为（2.02±0.85）%、（24.02±6.12）%、（18.78±4.55）%、（15.56±4.15）%、（10.25±3.36）%及（10.60±3.50）%，组间差异有统计学意义（P＜0.05）。

  与对照组比较，糖尿病组胰岛β细胞凋亡率升高（P＜0.05）；与糖尿病组相比，黄连化浊胶囊低、中、高剂量组级双胍干预组胰岛β细胞凋亡率均降低（P＜0.05）；黄连化浊胶囊3个剂量组间比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；黄连化浊胶囊高剂量组与双胍干预组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

  与对照组比较，糖尿病组GRP78及ATF6阳性细胞数均升高（P＜0.05）；与糖尿病组相比，黄连化浊胶囊低、中、高剂量组级双胍干预组GRP78及ATF6阳性细胞数均降低（P＜0.05）；黄连化浊胶囊3个剂量组间比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；黄连化浊胶囊高剂量组与双胍干预组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

  与对照组比较，糖尿病组MCP-1、TNF-α蛋白水平升高（P＜0.05）；与糖尿病组相比，黄连化浊胶囊低、中、高剂量组及双胍干预组MCP-1、TNF-α蛋白水平均降低（P＜0.05）；黄连化浊胶囊低、中剂量组间差异无统计学意义（P＞0.05），与黄连化浊胶囊中剂量组相比高剂量组MCP-1、TNF-α蛋白水平降低，但高剂量组与双胍干预组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

  糖尿病的发病机制以IR及胰岛β细胞功能缺陷为主要致病机制，胰岛β细胞功能缺陷可推动疾病发生、发展。

  T2DM大鼠建模过程与人类T2DM疾病存在相似性，长期食用高脂高糖饲料会产生糖脂代紊乱，导致IR，注射STZ后造成胰岛β细胞损伤。

  本文研究结果显示，糖尿病组大鼠血糖升高及IR显著，采用黄连化浊胶囊干预后均降低，说明其可改善IR而发挥降低血糖、增加体重的作用。

  二甲双胍是T2DM的一线治疗药物，可通过激活腺苷酸激活蛋白酶(AMP-activatedproteinkinase，AMPK)信号通路抑制肝脏糖异生及脂肪合成，加快肌肉对糖分利用，同时可调控胰高糖素样多肽-1(glucagon-likepeptide-1，GLP-1)分泌，改善胰岛素抵抗，达到降低血糖的目的。

  从中医方面出发，黄连性寒、味苦，归心、脾、胃、胆及大肠经，泻毒、清燥、除湿、止消渴。

  法半夏性温，味辛，归胃及脾脏，健脾除燥，温胃降逆；竹茹微寒性，味甘，能清肺、除燥。

  枳实味苦，性寒，归胃、脾经，破气、痰化、痞胀消，陈皮味苦、辛，性温，归肺、脾经，理气健脾，燥湿化痰。

  茯苓味甘、淡，性平无毒，归心、脾、肺，肾四经，利水渗湿、脾虚泄泻、痰湿入络；炙甘草味甘气温，调和诸药，全方共奏清热解毒、运脾化浊之效。

  现代药理学表明，黄连化浊胶囊中黄连及鸡内金均具有抗氧化能力，黄连中小檗碱可促进胰岛素分泌而改善IR，鸡内金具有调节血糖血脂的作用，降低肝脏中脂肪累积，提高胰岛素敏感性。

  康学东等研究表明，黄金胶囊灌胃后可改善T2DM大鼠IR，提高胰岛素敏感性，发挥降低血糖的功效。

  GRP78是ERS中主要的分子伴侣蛋白，也是内质网发生的标志蛋白，在正常生理状态下其与下游3个受体及ATF6形成稳定结构，ERS发生后ATF6从结构中解离转到高尔基上，被蛋白酶S1p及S2p切割后参与ERS相关蛋白的转录及表达。

  本文研究结果为，黄连化浊胶囊灌胃后大鼠的胰岛β细胞凋亡率降低，同时ERS标志蛋白GRP78及ATF6水平也有所降低，说明其能够大大减少胰腺ERS、抑制胰岛β细胞的凋亡。

  黄连化浊胶囊臣药黄连中主要药理成分小檗碱能够抑制GRP78水平，改善应激反应，缓解T2DM胰腺损伤。

  詹玫琦等研究之后发现，中药黄连能够降低T2DM大鼠血脂紊乱水平、抑制胰腺脂毒性与降低ERS蛋白GRP78、CHOP、ATF4的表达相关。

  高血脂大鼠中IL-1β、IL-6、TNF-α及MCP-1等炎症因子表达均升高，采用黄连半夏可通过抑制核因子κB活性降低TNF-α及MCP-1等炎症因子表达，由此减少机体氧化应激损伤，推测其能够最终靠抑制炎症因子激活改善ERS损伤，减少胰岛β细胞凋亡，提高胰岛素敏感性，降低血糖。

  综上所述，黄连化浊胶囊可降低T2DM模型大鼠血糖水平，降低IR，同时改善胰腺ERS，减少胰岛β细胞的凋亡，其机制可能与抑制MCP-1、TNF-α蛋白表达水平相关。