玉米（Zea mays）是世界三大粮食作物之一，也是重要的饲料作物，是世界农业生产中的重中之重。玉米生长过程中极易受到外界环境及各种病虫害的干扰，严重影响其品质和产量。人们开始利用基因工程手段将外源基因导入玉米中，以提高玉米对环境与病虫害的耐受性。为了充分保障消费者的知情权，各个国家与组织机构要求企业对生产的转基因产品做标识。转基因产品“标识阈值”的实施尤其需要对样品中的转基因成分进行定量检测。传统的实时聚合酶链式反应（real-time PCR）技术一次只能实现检测一个靶标，需要多次扩增和检测才能满足多靶标转基因成分检测的需求，而新兴的二代测序技术弥补了该传统技术的缺陷，明显提高了检测效率。

  江汉大学生命科学学院的陈利红、陈红、彭海*等人基于现有文献中报道的玉米、水稻、大豆等植物中的内标准基因及其定义，从玉米基因组中选择7 个候选内标准基因，共设计13 个扩增区域（扩增子），利用二代测序技术对这些内标准基因的扩增子进行种内一致性、种间特异性等系统性评估，进而为后续利用二代测序技术对转基因玉米的定量检测提供合适的内标准基因扩增子。

  根据文献中或者国家标准中报道内标准基因及其定义，共筛选7 个内标准基因，分别为zSSIIb、zein、ADH1、IVR、HMG、E3-UBI和HSP70。为了确定同一个内标准基因不同的扩增区域是否对其检出有影响，每个内标准基因拟计划设计2 对引物。设计结果为除了IVR只设计出 1对引物外（该基因设计的另外一对引物和引物组的其他引物容易形成二聚体），其他基因均设计出2 对引物，因此共有13 个扩增子区域。利用在线 个扩增子进行拷贝数分析，发现这些内标准基因的13 个扩增子在玉米基因组上均只有1 个拷贝（表2）。

  通过对待检的208 个玉米样品进行建库、测序与分析，发现IVR（京BD123096、京BD122945）与HSP70-1扩增子（雅玉98和增玉1572）均只有两个样品没有被检出（图1），检出率为99.0%；zein-2扩增子在11 个样品中（伟科7、京BD123096、京BD122314、京BD121602、京BD124360、京H113417、京H101662、京BD122945、锦华336、冀植选3和高诱2号）没有被检出，检出率为94.7%；而剩余的10 个扩增子在所有样品中均有不同丰度的检出，检出率为100%；说明这些扩增子在玉米种内的一致性均较好。

  此外用建库起始DNA量相等（200 ng）的25 个玉米品种对所选7 个内标准基因的13 个扩增子进行检出丰度分析。结果显示每个内标准基因的各扩增子在所有样品中均被检出（图2），同一个内标准基因，除了ADH1内标准基因的两个扩增子ADH1-1和ADH1-2检出丰度相对来说还是比较接近外，其他5 个内标准基因的2 个扩增子检出丰度均有一定差别，说明同一个内标准基因的不同扩增子检出丰度有差异。在13 个扩增子中，zSSIIb-1检出丰度最高，其次为E3-UBI-1、HSP70-2和zein-1，它们检出丰度均变异较大，而zein-2、ADH1-1、ADH1-2、HMG-2、E3-UBI-2与HSP70-1的变异较小（标准偏差均在100以内）。从检出率及检出丰度高低看，zSSIIb-1作为内标准基因相对较好，但其在各样品的检出丰度变异较大。为了验证丰度变异较大的zSSIIb-1扩增子在普通琼脂糖电泳图上的目标条带亮度是否差异较大，用zSSIIb-1引物对检出丰度高低不一的8 个样品进行普通PCR验证，发现zSSIIb-1检出丰度在2000～3000 条reads的样品，其PCR产物在琼脂糖凝胶上的条带亮度差异并不大（图3），因此直接通过琼脂糖电泳图无法精准确定各扩增子的检出丰度。

  利用其他非玉米样品如水稻（5 个样品）、棉花（3 个样品）、大豆（4 个样品）、花生（1 个样品）、西瓜（2 个样品）、黄瓜（2 个样品）、甜瓜（2 个样品）、番茄（2 个样品）、辣椒（2 个样品）、白菜（2 个样品）10 个非玉米物种的25 个样品，对这些内标准基因的扩增子进行种间特异性评估，结果发现这25 个样品均未建库成功，理论上来讲这是由于建库所用的引物是针对玉米内标准基因特异设计而造成。为了排除建库的问题，以大豆4 个样品的第一轮PCR产物为模板，利用文献报道的大豆内标准基因引物进行PCR扩增与电泳检测，结果发现大豆的4 个样品均能扩增出lectin基因的目标条带，排除了建库的问题，充分说明了所选内标准基因扩增子的种间特异性。

  通过测序分析每个内标准基因的扩增子序列，能够得到每个扩增子在各样品中的拷贝数目是否和理论值一致，同时确定其是否含有SNP或者插入缺失序列（InDel）。分析结果为：这7 个内标准基因的13 个扩增子在各样品中的拷贝数目确实和理论值一致，均只有一个拷贝。zein-1与IVR既含有SNP也含有InDel，而E3-UBI-1与之相反，两者均无，HMG-2只含有1 个InDel，剩余的其他扩增子序列均含有1～11 个SNP（表6）。内标准基因应选择种内保守性较好的基因，如本研究E3-UBI内标准基因的E3-UBI-1扩增子。对于含有较密集SNP或者InDel的扩增子，若后续研究用其作为内标准基因并自己设计引物时，不仅要考虑扩增子的长度，还需注意避开这些SNP或者InDel位置，以免影响其扩增效率或检出率。如本研究中的IVR，其扩增长度较长263 bp，内部又含有SNP和InDel，可能是导致其检出丰度较低、稳定性差的原因。

  geNorm软件通过计算每个内标准基因在不同样品中检出丰度的稳定性值（M值）确定其稳定性，M值越小说明内标准基因的稳定性越高，反之则越低。geNorm软件通常会将稳定性M值低于1.5的基因作为内标准基因。利用geNorm软件对所筛选的7 个内标准基因的13 个扩增子的稳定性做多元化的分析。结果显示这7 个内标准基因的13 个扩增子的M值均小于1.5，说明它们均可选为内标准基因（图4），其中最稳定的是扩增子ADH1-1与ADH1-2，最差的是IVR。

  geNorm软件还可通过计算内标准基因的配对变异系数（pairwise variation value，V n /V n+1 ）确定内标准基因的最佳数目。通常以0.15作为临界值确定内标准基因的最适数量。如果配对变异系数小于0.15，表明n个内标准基因已经稳定，无需引入第（n＋1）个内标准基因，即能够很好的满足相对定量的要求，反之亦然。分析根据结果得出在测试稳定性的扩增子中，最稳定的两个扩增子为ADH1-1与ADH1-2，配对变异系数V 2 /V 3 小于0.15，表明选择这2 个扩增子即可满足定量检测的需求。

  NormFinder与geNorm类似，也是通过计算内标准基因检出丰度的M值评价内标准基因的稳定性，M值越小则其稳定性越高。NormFinder分析结果为，ADH1-2扩增子的稳定性最高，IVR最差（表7），该结果与geNorm软件的分析结果一致。此外这两个软件的分析结果为，M值排序从第8个开始，后面6 个扩增子的排序都一样。

  内标准基因的动态检验测试范围分析结果为这些内标准基因的扩增子除HSP70-1在1 个样品（M000036的1000 倍稀释，DNA总量0.2 ng）中没有检出外，其余扩增子在DNA量检测下限为0.2 ng时，均能被检出，说明所选内标准基因的检测灵敏度较高（图5）。具体地，在所测5 个玉米品种（品系）的各稀释梯度，IVR、HSP70-1、E3-UBI-2与HMG-2检出丰度较低（绝大数小于100 条reads），并且这4 个扩增子在各个品种（品系）的不同稀释梯度的检出丰度几乎无差异；与IVR、HSP70-1、E3-UBI-2和HMG-2的相反，zSSIIb-1扩增子的检出丰度较高（最低为337，平均值1640.852），zein-1、zein-2、zSSIIb-2、ADH1-1、ADH1-2、HMG-1、E3-UBI-1与HSP70-2检出丰度相对次之，但这9 个扩增子的检出丰度均不随样品DNA的稀释梯度的变化而成比例变化。这样进行转基因成分定量时，选不一样的内标准基因会呈现不同的检测结果，尤其对混杂不一样的物种的转基因样品（如食品中混了不同浓度的转基因玉米和大豆）进行仔细的检测时，定量检测将变得更复杂，需要联合几个内标准基因，并利用标准品设置矫正系数才能对样品中的DNA含量或转基因成分进行精准定量。

  转基因玉米非常容易通过非法途径混入我国食品市场，这不仅会对消费的人的食用安全造成威胁，还可能会因此扰乱我国在转基因食品上的监管。转基因产品的监管、检测以及作物成分的鉴定均要以内标准基因为基准，因此内标准基因及其扩增区域的筛选与评估显得很重要。到目前为止，已开发的玉米内标准基因有ADH1、IVR、zein、zSSIIb、HMG。zSSIIb是我国转基因玉米检验测试标准中较常用的，而ADH1基因是欧盟转基因玉米检验测试标准中常用的。本研究利用二代测序技术对上述几个常用的玉米内标准基因及其他植物中报道的两个内标准基因在玉米中同源物（E3-UBI和HSP70）的扩增子进行了种内一致性、保守性、种间特异性、检出丰度及动态检验测试范围进行评估。

  通过对所选的7 个内标准基因13 个目标扩增区域的高通量测序数据分析发现，这13 个扩增子在208 个样品中的检出率为94.7%～100%，而在非玉米的水稻、大豆、棉花、白菜等物种中均无法被有效检出，说明这些内标准基因的种内高度一致性与种间的高度特异性。其中zSSIIb-1检出丰度最高，其次为E3-UBI-1、HSP70-2和zein-1，IVR检出丰度最低，然而zSSIIb-1检出丰度在各个样品中变异较大，这可能与设计的扩增子引物区域的保守性、扩增子长度、引物扩增效率及样品DNA浓度等多种因素相关。其中引物的保守性及扩增子的长度可能对扩增子的检出丰度影响更大，如本实验所选的E3-UBI-1扩增子非常保守，既没有SNP，也没有InDel，其检出丰度相比来说较高；而IVR与之相反，两者均有，加上测序长度单端只有150 bp，致使IVR在检测的所有样品中的检出丰度均较低，因此建议若后续使用IVR作为内标准基因时，可考虑重新设计引物，并且引物不要设计在含有SNP和InDel的区域，扩增长度短些。

  此外，本研究还利用geNorm和NormFinder软件分析了7 个内标准基因13 个扩增子的稳定性，分析结果均表明最稳定的内标准基因扩增子是ADH1-2，最不稳定的是IVR。动态检验测试范围分析结果为，检出丰度稳定性最好的ADH1-2与种内最保守的E3-UBI-1扩增子在文库构建的DNA用量检测下限为0.2 ng时，均还能在样品中被稳定检出。因此从种内保守性与检出稳定性综合看，利用扩增子测序法对转基因产品做检测时，优选E3-UBI-1与ADH1-2这两个扩增子相对较好。但具体这些内标准基因扩增子如何组合才能精准定量玉米产品中的转基因成分，目前研究团队还在攻关中。

  彭海 教授，中国科学院遗传发育生物研究生博士后，现任江汉大学系统生物学研究院常务副院长。彭海教授潜心生物基因鉴别判定技术开发与推广工作17 年，原创发明了多核苷酸多态性（MNP）标记技术，鉴定精准性、高效性、共享性和智能化水平实现质的飞跃，技术知识产权实现完全独立自主，技术高端产品链实现全程国产化。经同行专家评价，该技术发明填补了国内外植物品种实用精准高效DNA指纹鉴别判定技术的空白和实质性派生品种鉴定标准的空白，整体达到国际领先水平。主持国家、省、市纵向项目23 项，获横项经费上千万；以第一或通讯作者发表论文32 篇（其中SCI收录15 篇，1区4 篇）；以第一发明人获发明专利17 项，新品种权2 项；以第一完成人制定国家标准3 项（其中1 项为全国首个实质性派生品种鉴定标准；以第一完成人获得湖北省高价值专利大赛金奖1 项。开发了全国首个农作物种质资源区块链存证平台并上线运行，便捷固定了种子身份指纹数据；构建了全国水稻、玉米、小麦等3 种作物授权品种标准DNA指纹数据库，为种子权利保护提供了有效证据，为种子自由流通提供了信任机制；主持原创发明技术在植物、动物、微生物等生物鉴定领域获得19.67万份次大范围的应用，服务社会产生经济效益10 亿元。原创技术被写入了农业农村部、湖北省、武汉市等多项政府规划性文件，获农业农村部、湖北省领导多次批示。

  陈红 研究员，男，汉族，四川宣汉县人，农学博士，研究员。现任农业农村部科技发展中心转基因生物安全检定处处长，农业农村部生物技术产品质量安全检验测试中心副主任，农业农村部农业转基因生物溯源重点实验室学术委员会副主任委员，中国政法大学兼职教授，中组部第17批博士团挂职海东市平安区人民政府副区长。2002年7月参加工作，2008年12月加入中国农工，2022年11月加入中国。该同志作为全国 27家植物新品种测试和42 家转基因检验测试的机构牵头人，锚定技术创新、制度创新契合点，首次系统论述提出建立实质性派生品种制度建议并列入《种子法》。主持生物育种重点项目快检技术课题，开展抗性治理、定量标识配套技术探讨研究。联合发明多核苷酸多态性分子鉴别判定技术，参与制订34 种作物品种鉴定和转基因检测国家标准，有力支撑《种子法》实施和生物育种产业化应用。发表论文40多篇，专著1 部，参编著作6 部。获发明专利10 项，河南省科技进步奖一等奖1 项，中华农业科技奖二等奖 1 项，湖北省高价值专利金奖1 项。获全国植物新品种保护先进个人，优秀援青博士称号。“草帽博士”事迹在人民网、农民日报、青海日报等媒体报道。

  陈利红 副研究员，华中科技大学生命科学学院博士，现任江汉大学生命科学学院副研究员。国际著名期刊《FOOD RESEARCH INTERNATIONAL》与《FRONTIERS in PLANT SCIENCE》审稿人。长期致力于转基因检测的研究，原创了可发现转基因新的转化事件的检测技术。主持国家、省、市纵向项目4 项，其中国家重大子课题单次获批经费达上百万；以第一或通讯作者发表论文12 篇（其中SCI收录4 篇）；以第一发明人获发明专利数6 项，软件著作权3 项。