血脑屏障存在于哺乳动物脑部结构中，为神经元功能创造离子稳态[1]，调节营养的东西或代谢物在血液和大脑之间的运输，保护中枢神经系统免受外来物质的伤害[2]。相比其他组织屏障，血脑屏障具有低通透性、高选择性及低胞饮特点，其对物质运输的严格调控使得药物的脑靶向运输成为难题[3-4]。适当地调节血脑屏障的通透性是临床中常采用的手段[5]。

  川芎 Chuangxiong Rhizoma 是现代临床中治疗头痛的常用中药之一 [6-7] 。《医学启源》（金 · 张元素）记载：“川芎属风药，能升散，轻清上达，充塞头顶，引药上行至脑，直达病所 [8] ”。一项探析风药对血管性痴呆各种证型治疗效果的研究之后发现川芎可引他药直达脑络 [9] 。研究发现川芎与复方舒郁健脑方配伍可增加酸枣仁皂苷 A 在小鼠脑组织中的蓄积 [10] ，与天麻配伍可提高天麻素苷元在脑内的生物利用度 [11] 。 Zheng 等 [12] 进一步发现川芎成分藁本内酯、洋川芎内酯 A 、洋川芎内酯 I 可降低 MDCK-MDR1 细胞单培养血脑屏障模型的跨细胞内皮电阻值，增加芍药苷、松果菊苷从顶端侧到基底侧方向上的表观渗透系数。川芎具有引导他药通过血脑屏障上行于头部 [13] 的作用，但目前缺乏具体阐述川芎对血脑屏障通透性的研究数据，且对体外血脑屏障模型通透性的研究只集中在少数成分（藁本内酯、洋川芎内酯 A 、洋川芎内酯 I ）。故本研究考察川芎对血脑屏障通透性的作用及机制，以期为相关研究提供依据。

  SPF 级雄性昆明小鼠 118 只，体质量 19 ～ 22 g ，购自北京斯贝福生物技术有限公司，实验动物使用许可证号 SCXK （京） 2020-0033 ，饲养于北京中医药大学动物房屏障环境中（伦理批准号 25 ）， 24 h 光照和黑暗循环，温度（ 20 ± 2 ）℃，相对湿度（ 50 ± 10 ） % ，正常饮食，自由饮水。

  Milli-Q Advantage A10 型纯水仪制备系统、旋转蒸发仪（东京理化器械株式会社，配备有 N-1300 型旋转支架、 OSB-2200 型水浴锅、 WELCH 真空泵）； Infinite M200Pro 型多功能酶标仪 [ 帝肯（上海）实验器材有限公司 ] ； MM400 型珠式样品匀浆仪（上海弗尔德上海仪器设备有限公司）； Mini-PROTEAN Tetra Cell and PowerPac Basic Power 垂直电泳系统套装（伯乐生命医学产品有限公司）； Amersham Imager 680 型化学发光成像仪 [ 思拓凡生物科学技术（杭州）有限公司 ] ； SQP-PRACTUM224-1CN 型分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）； 3K15 型高速冷冻离心机（默克西格玛公司）； ERS-2 型跨内皮电阻仪（密理博中国有限公司）。

  川芎饮片分别以 12 倍量、 10 倍量 95% 乙醇加热回流提取 2 次，滤过，滤渣以 10 倍量水加热回流提取 2 次，滤过，合并滤液浓缩，得到质量浓度为 1 g/mL 的川芎提取液。

  2.2.1样品制备 川芎提取 物 稀释至 1 μg/mL ， 0.22 µm 微孔滤膜滤过，转移至棕色液相小瓶，待测。

  实验前动物禁食 12 h ，自由饮水。小鼠随机分 7 组（ n ＝ 10 ），其中 1 组为对照组，其他 6 组均为给药组。对照组 ig 生理盐水后麻醉，给药组 ig 川芎提取物（ 5.8 g/kg ，以生药量计），分别于给药 0.5 、 1 、 2 、 4 、 6 、 8 h 后麻醉， iv FITC-dextran （ 30 μg/g ，相对分子质量 4 × 103 ），循环 5 min ，从心脏灌流生理盐水后取脑组织。

  2.5.1 细胞培养 bEnd.3 细胞用含 10% 胎牛血清、 1% 青霉素 - 链霉素（ 10 U/mL ）的高糖 DMEM 培养基，于 37 ℃、 5% CO2 的培养箱中培养，按 1 ∶ 3 传代， 0.25% 胰酶（含 0.05% EDTA ）消化。冻存液为胎牛血清 - 二甲基亚砜（ 9 ∶ 1 ），每管细胞数≥ 1 × 106 个 /mL 。复苏时在 37 ℃条件下快速解冻转移至预热完全培养基中，吹打离心后常规培养。

  2.5.2 血脑屏障模型构建及评价 取生长密度 80% 的 bEnd.3 细胞，消化计数，调整细胞密度为 2 × 105 个 /mL 。取内表面铺被人血浆纤连蛋白 [15] 的 Transwell 小室，供给池加入 0.5 mL 细胞溶液，接收池加入 1.5 mL 完全培养基，细胞沉降后转移至培养箱中。供给池每天换液，接收池隔天换液。

  细胞贴壁后使用跨内皮电阻仪检测跨内皮电阻（ transepithelial resistance ， Teer ），计算组织电阻 Ω ， Ω 最高且维持稳定认为血脑屏障基本形成。

  Ω 实验 为细胞模型小室 Teer 值， Ω 空白 为对照小室 Teer 值， S 为小室底膜面积（ 1.1 cm2 ）

  2.5.3 分组及给药 实验分为对照组和不同浓度的洋川芎内酯 A 、洋川芎内酯 H 、阿魏酸、洋川芎内酯 I 、藁本内酯、欧当归内酯 A 、 4- 羟基 -3- 丁基苯酞给药组。对照组供给池加入含终质量浓度为 1 μg/mL Na-F 的完全培养基 0.5 mL ，接收池加入空白完全培养基 1.5 mL ；给药组供给池分别加入含终质量浓度为 1 μg/mL Na-F 和不同浓度（ 1 、 10 、 100 μmol/L ）药物的完全培养基 0.5 mL ，接收池均加入空白完全培养基 1.5 mL 。

  dQ/dt 表示转运时间 dt 内的药物转运速率（ μg/s ）， A 表示小室单层膜表面积（ cm2 ）， C0 表示初始荧光素钠药物质量浓度（ 1 μg/mL ）

  实验数据以 表示，使用 SPSS 17.0 软件进行统计与分析，采用单因素方差分析或双尾非配对 t 检验，使用 GraphPad Prism 6.02 软件作图。

  3.1.2 川芎影响血脑屏障通透性的定量结果 如图 1 所示，与对照组比较，给予川芎提取液 0.5 h 后，单位脑质量中相对分子质量为 4 × 103 的 FITC-dextran 含量明显地增加（ P ＜ 0.001 ），随给药时间延长，含量逐渐降低至对照组水平。如图 2 所示，与对照组比较，给予川芎提取物 0.5 h 后，相对分子质 量为 4 × 104 、 7 × 104 、 1.5 × 105 的 FITC-dextran 在小鼠脑组织中的含量无显著性差异。

  3.2.1 血脑屏障细胞模型评价 采用单层内皮细胞模拟正常状态血脑屏障。 bEnd.3 细胞呈多边形，汇合成片后呈现典型的铺路石样结构。模型在培养第 5 天时， Teer 值稳定为 60 Ω·cm2 ，（与报道 [19] 中的 70 Ω·cm2 基本一致）， Na-F 的 P app 值为 0.5 × 10 −6 cm/s ，（与报道 [20] 中甘露醇 4.9 × 10 −7 cm/s 基本一致），说明本研究中血脑屏障模型构建成功，可用于探究药物对通透性的影响。

  3.2.2 川 芎单体成分对血脑屏障细胞模型通透性的影响 给予 0 ～ 100 μmol/L 的洋川芎内酯 A 、洋川芎内酯 H 、阿魏酸、洋川芎内酯 I 、藁本内酯、欧当归内酯 A 、 4- 羟基 -3- 丁基苯酞后， bEnd.3 细胞存活率均大于 90% 。

  进一步比较给药后 0.5 h 洋川芎内酯 A 、洋川芎内酯 H 、洋川芎内酯 I 、阿魏酸的 Na-F Papp 百分比（给药组与对照组 Na-F 的 P app 比值）探讨其促透作用的强弱 [17] ，结果见表 2 ，相同浓度下洋川芎内酯 I 的 P app 百分比最高，表明洋川芎内酯 I 在 bEnd.3 单培养血脑屏障细胞模型中促透效应最强。

  本研究采用 FITC-dextran 、 Na-F 作为示踪剂，研究川芎提取物及单体成分对血脑屏障通透性的影响，通过 Western blotting 检测给药后脑组织或模型细胞中细胞间连接蛋白的表达变化，明确川芎对血脑屏障通透性的作用和机制。

  FITC-dextran 是评估体内血脑屏障通透性常用的指示剂，具有分子惰性、检验测试灵敏度高、体内清除速度快等优势 [21] ，同时具有利用自身不同相对分子质量评价多种物质（溶质、离子和蛋白质）在血脑屏障上通透性的优势 [22] 。生理状态下 0.2% 冰片可促进 FITC-dextran （相对分子质量 4 × 103 ）经角膜渗透，这说明了冰片作为眼部药物穿透促进剂的安全性 [23] 。 3 种标志物肌酐、 FITC-dextran （相对分子质量 4 × 103 ）和罗丹明 -dextran （相对分子质量 7 × 104 ）根据不同相对分子质量可对应确定肠道屏障中孔隙途径、渗漏途径和不受分子大小限制的病理性途径的通透性变化，用以区分肠道疾病中屏障特性的丧失属于紧密连接通透性增加还是上皮损伤从而辅助确认病程 [24] 。本研究结果为，小鼠给予川芎提取物 0.5 h 后，可明显地增加 FITC-dextran （相对分子质量 4 × 103 ）在脑组织中的外渗量，但对相对分子质量 4 × 104 、 7 × 104 、 1.5 × 105 的 FITC-dextran 外渗量无影响，说明川芎提取物给药后小鼠血脑屏障通透性增加，但对途经血脑屏障的物质分子直径有所限制；给药 8 h 后 FITC-dextran （相对分子质量 4 × 103 ）的外渗量降低至对照组水平，说明川芎提取物增加血脑屏障通透性的作用具有时效性，作用强度由强至弱。

  体外血脑屏障细胞模型是快速筛选出拥有非常良好血脑屏障渗透性的中枢神经系统疾病候选药物的有力工具。本研究结果为，川芎中的洋川芎内酯 I 、 A 、 H 及阿魏酸在给药时间内能明显地增加 Na-F 的 P app ，表明其均具有促透作用。已有研究发现，洋川芎内酯 I 、 A 在 MDCK-MDR1 血脑屏障模型中具有促透性，能够增加水溶性物质松果菊苷的 P app [12] ，与本研究结果一致。洋川芎内酯 H 和阿魏酸的促透性为本研究首次报道。洋川芎内酯 H 与洋川芎内酯 I 互为手性异构体，二者均易入脑，已有研究学者发现洋川芎内酯 H 可用于防治脑卒中 [25] ，本研究证明其在血脑屏障模型中具有促透性，但洋川芎内酯 H 作用强度不如洋川芎内酯 I ，分析原因可能是二者结构上的差别造成本身活性不同。阿魏酸及其衍生化产物可入脑 [26-27] ，常用于中枢神经系统疾病的治疗 [28] 。有必要注意一下的是，本研究中藁本内酯未显著改变 Na-F 的 P app 。然而有研究报道藁本内酯可下调 P-gp 的表达，从而增加芍药苷在 MDCK-MDR1 血脑屏障细胞模型中的转运 [29] 。本研究中使用的示踪剂非外排蛋白 P-gp 底物 [23] ，这可能是藁本内酯未显著改变 Na-F Papp 的原因。

  血脑屏障对大脑微环境严格的保护作用限制了药物靶向到达脑组织中的病变部位。增大细胞旁通透性是亲水性药物更可能透过血脑屏障的途径 [30] 。细胞旁通透性由紧密连接蛋白、黏附连接蛋白及彼此间相互作用控制。 Na-F 为水溶性小分子物质，主要是通过细胞旁途径运输，常将其渗透情况作为评价体外模型旁路通透性的指标 [31] 。 Na-F 在血脑屏障模型中的高透过率与模型的低 TEER 值保持一致，表明其渗透情况与模型的紧密程度有关 [32] 。洋川芎内酯 I 作用 0.5 h 时， Na-F 的 P app 最高，随给药时间延长，其有回到对照组水平的趋势，这与洋川芎内酯 I 调节 bEnd.3 细胞中紧密连接蛋白 ZO-1 、 Occludin 及 pERM/ERM 表达水平的结果基本一致。 ZO-1 联结跨膜连接蛋白与肌动蛋白细胞骨架 [33] ， ZO-1 失活将破坏紧密连接的实质结构 [34] 。 Occludin 与其他紧密连接蛋白的顺式相互作用增加紧密连接的复杂性，从而增强血脑屏障的屏障完整性 [35] 。各紧密连接蛋白与肌动蛋白或细胞骨架之间相互作用的改变会导致血脑屏障通透性增加 [36] ，如 ERM 蛋白是维持细胞间蛋白质膜定位所必需的锚定蛋白 [37] ， 研究报道银杏内酯可通过影响 p-ERM/ERM 的表达水平增加 Na-F 在 HCMEC/D3 和 HEB 共培养血脑屏障细胞模型中的透过量 [32] 。

  冰片是应用广泛的紧密连接调节剂。研究表明，大鼠给药冰片 0.5 h 时，大鼠血 - 视网膜屏障中内皮细胞的 Claudin-5 和 Occludin 发生细胞膜 - 细胞质向易位， 1 h 时胞质中 Claudin-5 和 Occludin 表达量达到峰值， 4 h 时表达量开始下降， 8 h 时恢复至对照组水平 [38] 。本研究表明，川芎提取物给药 0.5 h 时 Occludin 、 ZO-1 表达量降低， P-gp 表达量增高；给药 2 h 时 Occludin 、 ZO-1 表达量达到峰值， Occludin 、 ZO-1 表达量达到谷值；给药 8 h 时三者恢复至对照组水平。洋川芎内酯 I 给药 0.5 h 后， bEnd.3 细胞中 Occludin 、 ZO-1 、 p-ERM/ERM 蛋白表达量降低；给药 1 h 后均明显高于对照组水平；给药 8 h 后恢复至对照组水平，因此推测川芎具有与冰片类似的可逆性调节血脑屏障通透性的性质，其影响血脑屏障通透性的机制可能与可逆性调节 Occludin 、 ZO-1 、 P-gp 及 p-ERM/ERM 蛋白表达水平有关。

  综上，川芎在某些特定的程度上可增加血脑屏障通透性，且该作用具有时效性，是紧密连接调节剂的潜在开发对象，洋川芎内酯 I 是良好的候选成分。

  来 源：刘明妍，刘力榕，冯梦晗，朱美霞，张银环，闫晓宁，方 聪，屈碧琼，贾志鑫，刘 洁，肖红斌．川芎调节血脑屏障通透性的作用及机制研究 [J]. 中草药, 2024, 55(1): 138-147.

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