氢氘交换质谱(HDX-MS)适用于研究蛋白质在溶液中的动力学和相互作用，其能快速分析非变性蛋白中位于蛋白表面的氨基酸序列，大范围的应用于蛋白动态表位、活性位点的表征。HDX-MS平台通过低温UPLC分离提供自动化、在线的样品处理和分析。

  目前，HDX-MS装置的工作流程主要基于Peltier冷却的超高效液相色谱(UPLC)模块的LC-MS方法，但该系统价格昂贵，成本比较高，并且在低温条件下，流动相粘度增加导致高背压(可达-20,000 psi)，降低了LC的分离效率。而毛细管电泳(CE)在HDX领域有着更好的应用潜力。CE是一种成熟的分离多种类型分子的方法，在蛋白质组学研究中具有独特的价值。CE基于分析物在电场中的不同迁移率进行分离，分离速度取决于分析物的尺寸和电荷。20世纪90年代初，CE-MS开始应用于肽段水平的蛋白质和蛋白质复合物的分析。自此，CE-MS在多肽和蛋白异质体的检测中就显示出比反相LC-MS高10~100倍的灵敏度。近年来，HDX-MS领域的研究人员也聚焦于探究CE用于HDX-MS工作中的潜在优势。

  本文利用熔融硅毛细管电泳在零摄氏度下完成了氘代肽段和蛋白的淬灭、酶切和分离，该平台具备比较好的成本效益，易于装配于任何MS。CE装置的主要配件包括丙烯酸气密匣(图1A)、毛细管液相分离装置(图1C)和P-727聚醚醚酮三通组件(图1D)。丙烯酸气密匣用于接收N2，内部放有一个不锈钢小瓶装纳氘代背景电解液，能够允许高电压传导到分离毛细管。P-727聚醚醚酮三通组件联通高压电源和N2源，提供分离电压和N2，在毛细管出口产生离子。

  图1.Peltier冷却CE外壳+进样槽的结构。(A) 丙烯酸气密匣。(B) Peltier冷却单元所粘附的铝壳体的截面。(C) 毛细管液相分离装置。(D) 同轴三通阀nano电喷雾针。

  完成该毛细管平台(图1)的加工和组装后，作者评估了其性能，并将其与先前在微芯片电泳装置上发表的报道进行了比较。首先是峰值容量的评估。使用血管紧张素II(ATII)和甲硫啡肽(ME)作为分离标记的淬灭肽标准品，在0 ℃下，以1 % FA、25% ACN (BFS毛细管)和10% HAc(LPA毛细管)组成的氘代背景电解液(BGE)计算峰容量。与BFS毛细管相比，LPA毛细管除了峰容量值增加外，其序列覆盖率也显著增加。作者比较了0 ℃ CE到0 ℃ LC和微芯片电泳的峰容量值。结果显示，CE的上峰容量虽小于微芯片电泳方法，但序列覆盖率更高。而与LC相比，CE的峰值容量大大提高。

  氘质子在淬灭时和分析时中的回交(BE)也是HDX实验重点考察的因素之一。作者使用缓激肽(BK)、ATII和ME作为肽标准品对BE进行了评估。在0 ℃、20 kV的条件下对BFS毛细管和LPA毛细管分别来测试。根据结果得出，ATII在BFS和LPA毛细血管上的BE分别为20 %和34 %。ATII在LPA毛细管上的BE值与已报道的商业和实验室改装的UPLC平台的数据(28~36 %)相似，而在BFS毛细管上则接近直接进样完全氘代标准品达到的BE水平。此外，由于注入到毛细管中的样品量与LC所使用的样品量相比很低，在检测的质谱中没再次出现任何残留的迹象。

  作者对溶液中牛血红蛋白(Hb)进行了HDX，随后又进行了淬灭、胃蛋白酶酶切、低温毛细管电泳分离与质谱(MS)检测。图2显示了根据Kyte-Doolittle疏水性指数选择的6个肽段在不同分离条件下相应的电泳图谱和氘代速率。从图中能够准确的看出，LPA毛细管上分离的肽段峰形更对称，信号强度比BFS毛细管上高一个数量级左右。与BFS毛细管相比，LPA涂层的毛细管整体的氘标记保留绝对值较低，但氘代速率没检验测试到差异。虽然BFS毛细管迁移时间更快，但由于BFS毛细管在样品进样之间需要更加多的冲洗步骤，因此分析时间比使用LPA毛细管要长。

  图2.强度归一化的提取离子电泳图谱，显示了BFS和LPA毛细血管之间迁移时间的差异，以及标记Hb的消化性中的6个代表性肽的HDX动力学图。橙色的迹线显示了使用BFS毛细管分离的结果，紫色的迹线显示了使用LPA涂层毛细管分离的结果。肽段序列的注释及其对应的Kyte-Doolittle疏水性指数显示在右方。(左)在500 s标记时间点显示了代表性的峰形和迁移时间。(右)BFS毛细管中的氘代保留更高。误差棒表示一个标准差，每个时间点n = 3。有些多肽在所有孵育时间内只存在于LPA涂层中，因此上述六个面板其中的两个面板没有在BFS毛细管中的痕迹。α 136 - 141在BFS毛细管上分离的特定样品在500 s时间点显示，但在以后的时间点只有少数的质量，从最终的数据集中省略，因此HDX动力学图不包括该肽段。β 35 - 40没有被检测到，也未被包括在HDX动力学图中。

  最后，本文研究了HDX CE-MS平台在表征结构相关信息方面的作用。作者比较了非变性条件下的Hb样品与用6 M尿素置于变性条件下的Hb样品的相对氘代值。研究之后发现，在非变性状态下更容易受到HDX保护的位点与Hb亚基的相互作用位点相吻合。具体来说，α-Hb上的R32-Y43和L92-D127以及β- Hb上的R29-E42和D98-Q130与这两个单体相互结合的位置相吻合。多个方面数据显示(图3)，与局部区域的尿素暴露状态相比，Hb的非变性状态对HDX的敏感度降低。这一发现验证了该方法可作为结构蛋白质组学研究的潜在工具——能够表征分子结合和构象动力学，如蛋白质-配体相互作用中遇到的问题。

  图3. Hb的HDX数据在PDB 1FSX上的映射。在非变性条件下用D2O标记的Hb与用6 M尿素变性后标记的Hb作比较。颜色刻度表示50,000 s氘掺入后，天然/尿素D吸收量的比值。

  总的来说，本研究提供了低温CE - MS应用于溶液内标记HDX的理论证明。尽管BFS毛细管提供了快速的肽段分离和标记肽段的最小氘损失，但研究根据结果得出LPA涂层的毛细管在HDX CE - MS中更有优势。有很多途径可以在一定程度上完成该平台的逐步优化，包括但不限于BGE优化(pH、有机质含量、浓度)、浓缩/脱盐步骤、固定化/嵌入式蛋白酶消化、升级Peltier元件以实现更低温的分离、集成无鞘电喷雾界面、交替毛细管涂层和评估更长或更短的毛细管。进一步研究蛋白质化学中常见的盐和溶质分离的耐受性也将是未来优化的一个重点。

  龙岩新罗产业园区建设发展有限公司120.00万元采购切割机,红外热成像仪,超声波清洗器,测温仪

  中国食品科学技术学会发布《食品中霉菌酵母的快速检测 测试片法》等3项团体标准征求意见稿

  GlycoSLASH：用谱聚类和谱库搜索从多个相关的LC-MS/MS数据集同时鉴定糖肽

  高灵敏Top-down蛋白组学方法捕获单个肌肉细胞的proteoforms异质

  Top-down纳米蛋白组学研究进展：开拓数字微流控和磁珠样品前处理方法